Primer adelantado del Río de la Plata, 1536-1537; primer fundador de la ciudad de Buenos Aires. Nació en Guadix, España, de noble y acaudalada familia, poco se conoce acerca de la primera parte de su vida, educación o carrera; según rumores habría amasado su fortuna en el saqueo de Roma, pero aparentemente nunca tuvo mando militar. 
Era una conocida figura en la corte de Carlos V; cuando el emperador decidió ocupar las tierras exploradas por Sebastián Gaboto y Diego García, y abrir una ruta terrestre a través de la región del Río de la Plata, desde el Atlántico hasta el imperio incaico, que estaba siendo conquistado por Francisco Pizarro, Mendoza solicitó y obtuvo el codiciado contrato para la expedición; firmado el 21 de mayo de 1534; pocas horas después del otorgado a Diego de Almagro para la conquista de Chile, el contrato concedió a Mendoza el título y privilegios de adelantado, incluyendo la designación de gobernador y capitán general vitalicio, de la región del Río de la Plata extensivo a través del continente hasta incluir alrededor de 200 leguas a lo largo de la costa del Pacifico, comenzando donde terminaba la jurisdicción otorgada a Almagro (geográficamente confusa).
Debía colonizar las tierras fundando ciudades, especialmente a lo largo de la costa del Pacífico, una vez abiertas las rutas terrestres, y convertir a los indios al cristianismo; se le prometió un condado y un estipendio anual de dos mil ducados y dos mil adicionales, ambos sufragados por las utilidades devengadas por la empresa; el proyecto obtuvo de inmediato apoyo general y voluntarios, de entre quienes, uno de los primeros en solicitar su participación fue el veterano navegante del Río de la Plata, Diego García, que capitaneaba su propia carabela. 
La partida se demoró alrededor de un año debido a la enfermedad de Mendoza, pero salió de Sanlúcar el 24 de agosto de 1535 con once navíos, aproximadamente mil doscientos hombres (las cifras difieren según los informes) incluyendo alrededor de cien alemanes -Carlos V había especificado que debían incluirse extranjeros-; Diego de Mendoza, hermano del adelantado, navegó como almirante y los cargos más prominentes fueron desempeñados por notables: Juan de Ayolas, Domingo Martínez de Irala, Juan de Salazar, Gonzalo de Mendoza, Francisco Ruiz Galán-; destinados a ser llamados conquistadores, o padres fundadores en los albores de la historia del Plata; fueron también transportados cien caballos, cerdos, aves de corral y herramientas, implementos, provisiones y equipos para facilitar un asentamiento permanente; la escuadra se detuvo en las islas Canarias y de Cabo Verde para reabastecerse de provisiones y refuerzos.
Llegó a Río de Janeiro a fines de noviembre de 1535; otra vez enfermo, Mendoza delegó la responsabilidad en Juan de Osorio, su segundo comandante; inculpaciones llegadas a Mendoza contra acciones de Osorio tuvieron como resultado la inmediata ejecución de éste, actitud considerada generalmente como precipitada, mal aconsejada e ilegal, con efecto desmoralizador sobre toda la expedición; luego de dos semanas en Río de Janeiro las embarcaciones prosiguieron viaje rumbo al Río de la Plata. 
A principios de 1536 Mendoza iniciaba su expedición río arriba y el 2 de febrero, sobre la margen meridional fundó el primer asentamiento en el Río de la Plata-; Puerto de Nuestra Señora Santa María del Buen Aire (Buenos Aires); se construyó una iglesia, la residencia del adelantado y viviendas hechas con una mezcla de barro y paja (no se disponía fácilmente de madera y piedra); los indios querandíes, (alrededor de dos mil en las cercanías) se mostraron amistosos durante cierto tiempo, intercambiando productos de la caza y de la pesca por mercancías comerciables españolas, pero desaparecieron luego; hambrientos españoles enviados para encontrarlos retornaron maltrechos y sin alimentos; con la supervivencia en peligro, Mendoza destacó una expedición punitiva contra los aborígenes, conducida por Diego de Mendoza, y constituida por trescientos lanceros y veinte jinetes; éstos sufrieron una desastrosa derrota a manos de los indios el 15 de junio de 1536 en las márgenes del río Luján (así llamado por Pedro Luján, uno de los españoles muerto en el lugar). 
Los caballos se atascaban en las zonas pantanosas, mancados por las boleadoras; alrededor de treinta españoles murieron, incluso Diego de Mendoza; a partir de entonces los españoles se defendieron a duras penas en Buenos Aires, viviendo en constante temor de los ataques indios, con antorchas y flechas encendidas para destruir sus viviendas; se estaba a la espera de noticias de las exploraciones de Ayolas que había ido en busca de una ruta hacia el Perú, así como de un lugar mejor para acampar y proveerse de alimentos y se aguardaban asimismo víveres del Brasil.
Mendoza, moribundo, delegó el mando del poblado al capitán Francisco Ruiz Galán hasta que Ayolas regresara para reasumir el mando y partió para España; murió en el mar el 23 de junio de 1537; dejó tras él a conquistadores que finalmente llevarían a cabo los términos del contrato; explorar y colonizar el país -desde la base en Asunción (Paraguay), capital del Río de la Plata durante los primeros ochenta años-, hallar las ansiadas rutas que habrían de conectar las colonias españolas del Pacifico y del Atlántico en América del Sur; los caballos (sobrevivieron setenta y dos en el viaje de un total de cien), dejados atrás cuando el remanente de los pobladores del asentamiento de Mendoza en Buenos Aires se trasladó a Asunción (1541), se multiplicaron rápidamente en las pampas y jugarían un papel trascendental en la sociedad y economía criollas, al igual que en la transformación de dispersos indios nómades de las pampas en bandas bien montadas de jinetes que vivían del saqueo a los asentamientos españoles.